17 Northern杂交与斑点杂交课稿

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  •   17 Northern杂交与斑点杂交课稿_高等教育_教育专区。第17讲 核酸杂交技术 -------Northern杂交与斑点杂交 温故知新 我们一起回顾上节课所学的Southern杂交: 一、DNA的变性 二、DNA的复性 三、核酸分子杂交技术 四、S

      第17讲 核酸杂交技术 -------Northern杂交与斑点杂交 温故知新 我们一起回顾上节课所学的Southern杂交: 一、DNA的变性 二、DNA的复性 三、核酸分子杂交技术 四、Southern杂交的原理和主要步骤 基本内容 一、Northern杂交的由来 二、Northern杂交的用途 三、Northern杂交的基本流程 四、Northern杂交的优点和缺点 五、Northern杂交、Southern杂交和Western杂 交的区别 六、斑点印迹杂交的原理 七、斑点印迹杂交的基本流程 八、课堂小结 九、作业 一、Northern杂交的由来 Northern杂交由斯坦福大学的 George Stark教授于1975年发明。其 原理是在变性条件下将待检的RNA样 品进行琼脂糖凝胶电泳,继而按照同 Southern Blot相同的原理进行转膜和 用探针进行杂交检测。 之所以命名为Northern杂交是 因为其原理与Edwin Mellor Southern教授发明的southern杂交 原理相似,实验过程也相似,所以 取了一个类似的名字叫Northern杂 交。 二、Northern杂交的用途 ? 1、检测外源基因在宿主中能否转录。 有无 大小 多少 ? 2、检测mRNA长度分子量大小,提供有 关RNA完整性信息和不同的剪接信息。 (依电泳迁移率估计); ? 3、mRNA的含量,即基因表达高低。 (密度扫描仪,定量分析) 三、Northern 杂交的基本 流程 三、Northern杂交的基本流程 1、RNA的提取 ①样品细胞的有效破碎 ②使核蛋白复合体变性 ③对内源RNA酶的有效抑制 ④有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分 离 三、Northern杂交的基本流程 1、RNA的提取 一个标准的印迹程序,第一步是提取样本的总RNA,在 通过挂有oligo(dT)的色谱柱通过亲和层析分离纯化总RNA 中的mRNA。然后通过甲醛变性胶将mRNA进一步按 大小分离开。并通过溴化乙啶(EB)染色在转印前来检 查RNA的质量。 也可以使用含有尿素的的聚丙烯酰胺胶在分离已经片 段化的RNA和小RNA。在跑电泳时可加入RNAma rker以方便对RNA大小的观察。 当然,在总RNA样品中,核糖体亚基也可以充当 marker的功能(28s的条带相当于5kb,而18s相当于 2kb)。 三、Northern杂交的基本流程 2、转膜 2、转膜 三、Northern杂交的基本流程 Northern杂交所用的是尼龙膜带 有正电荷,对带有负电性核酸具有高 亲和性。在转膜时使用的转膜缓冲液 里面含有甲酰胺,甲酰胺可以降低杂 交时RNA的退火温度以防止由于高温而 产生的RNA的降解。在热和紫外线的作 用下,RNA于尼龙膜间形成了共价键, 从而被固定住。当探针与之结合时, 特定的RNA就在膜上被标记了下来。 三、Northern杂交的基本流程 3、杂交 杂交的效果受到离子 强度、黏度、碱基的错配、 探针的序列的因素影响。 杂交结束后,在洗膜时, 一定要保证将没有杂上的 探针清洗干净,才能保证 高信噪比。最后,使用X 光片进行显影,并进行定 量。 三、Northern杂交的基本流程 3、杂交 Northern杂交可以选用放射性同位素 标记或地高辛(DIG)和生物素(BIOTIN) 标记的RNA探针或DNA探针。 RNA探针具有显示更强的杂交信号和 更低的非特异性背景的优点,因此只要可 能, George Stark可尽量选用RNA探针。 但由于RNA的不稳定性,RNA探针在 操作上的要求和难度要比使用DNA探针高 很多,因此大多数研究者仍使用DNA探针。 四、Northern杂交的优点与缺点 优点 如今在做基因的表达分析时,有多种 技术可供选择,包括:RT-PCR、RNA酶 保护试验、微阵列、基因表达的系列分析 以及northern杂交。 虽然,微阵列基因芯片技术被广泛应 用,但在对特定基因微小的表达量变化的 测定上,northern杂交的灵敏度还优于微 阵列技术。 四、Northern杂交的优点与缺点 缺点 1、微阵列技术优于northern基因的地方主要是它 可以大通量的同时检测数千个基因,这是 northern杂交所做不到的。 2、在试验中大量用到有毒有害的试剂包括:DEPC、 甲醛、EB、紫外线、放射性同位素等。对于研究 人员具有很大的危害。 3、Northern blot的操作步骤相当繁琐,且对 RNase污染非常敏感,任一步操作不当都会严重 影响实验结果。 五、Northern杂交、Southern杂交 和Western杂交的区别 1、原理不同 ? Southern杂交的原理:将待检测的 DNA样品用限制酶消化固定在固相载 体上,变性后与标记的核酸探针进行 杂交,在与探针有同源序列的固相 DNA的位置上显示出杂交信号。通过 Southern杂交可以判断被检测的DNA 样品中是否有与探针同源的片段以及 该片段的长度。 五、Northern杂交、Southern杂交 和Western杂交的区别 1、原理不同 ? Northern杂交的原理:在变性条件下先将待 检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳,继而 按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和 用探针进行杂交检测。Northern杂交与 Southern杂交相比,条件要严格些,特别是 RNA容易降解,前期制备和转膜过程易受 RNase污染,要获得较好结果,需用稳定性 最差的mRNA与DNA进行杂交,对实验条 件要求严格; 五、Northern杂交、Southern杂 交和Western杂交的区别 ? 1、原理不同 ? Western杂交的原理:先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋 白,将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中,经 SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离,再把分离的 各蛋白质条带原位转移到固相膜(硝酸纤维素膜或尼龙膜) 上,接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育,以封闭其 非特异性位点。然后加入特异抗性体(一抗),膜上的目的 蛋白(抗原)与一抗结合后,再加入能与一抗专一性结合的 带标记的二抗(通常一抗用兔来源的抗体时,二抗常用羊抗 兔免疫球蛋白抗体),最后通过二抗上带标记化合物(一般 为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的特异性反应进行检测。 根据检测结果,从而可得知被检生物(植物)细胞内目的蛋 白的表达与否、表达量及分子量等情况。 五、Northern杂交、Southern杂交 和Western杂交的区别 2、研究对象不同 Southern杂交用于分析DNA; ? Northern杂交用于分析RNA; ? Western杂交用于分析蛋白质。 五、Northern杂交、Southern杂交 和Western杂交的区别 3、过程不同 Southern杂交:提取DNA-琼脂糖电泳-变性转膜-封闭-DNA/DNA或DNA/RNA杂交链-检测; ? Northern杂交:提取RNA-变性-琼脂糖电泳转膜-封闭- RNA/DNA或RNA/RNA杂交链-检 测; ? Western杂交:提取蛋白质-变性-SDS-PAGE 电泳-转膜封闭-抗原抗体反应-检测。 六、斑点印迹杂交 ? 斑点印迹(dot blotting)杂交: 简称斑点杂交或打点杂交。一般是把待 检的核酸样品点在NC膜上,变性后与标记 的探针进行结合反应,显影或显色后可检 测出杂交信号的强度,通过与对照样品比 较可以确定所测核酸量的高低。 根据膜上所点的核酸样品的种类不同 分类 DNA dot blotting RNA dot blotting 六、斑点印迹杂交 ? 如果用特殊的狭缝点样器点膜,得到的线状 杂交信号比圆点状信号更有利于结果的判 定和检测,这称为狭线印迹法或狭缝印迹 法(slot blotting)。 ? 斑点杂交主要用来检测细胞基因拷贝数的 变化或者mRNA含量的变化。它的操作简 便,提取的核酸不需经电泳和转印,直接 点在支持膜上。 六、斑点印迹杂交 优点 缺点 在同一张支持 膜上可以点多 份样品,便于 较大规模的检 测和筛选。 容易出现假阳 性,需要设立 严格的样品对 照。 七、斑点印迹杂交的基本流程 提取组织和细胞中的DNA或RNA ↓ 点样品至膜、干燥、固定 ↓ 探针、DNA变性 ↓ 杂交 ↓ 洗膜、放射自显影 ↓ 结果分析 八、课堂小结 九、作业 Northern杂交、Southern杂交和 Western杂交的区别 O(∩_∩)O谢谢

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